之前，我們分享了海藻糖用于人源少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）、脂肪來(lái)源干細(xì)胞、小鼠睪丸生精細(xì)胞等細(xì)胞類(lèi)型冷凍保護(hù)的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)向凍存液中添加一定量海藻糖或使用海藻糖+甘油復(fù)合型凍存保護(hù)劑，可以提升細(xì)胞長(zhǎng)期凍存后的復(fù)蘇活率。

本期，我們分享一篇來(lái)自意大利米蘭的研究者們2018年發(fā)表在《Stem Cell Research》上的文獻(xiàn)，看一下海藻糖海藻糖如何冷凍保存人類(lèi)多能干細(xì)胞？

1. 介紹

包括干細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞**產(chǎn)品具有很高的臨床潛力，全球干細(xì)胞市場(chǎng)包括上中游的干細(xì)胞存儲(chǔ)制備以及下游的臨床應(yīng)用。根據(jù)全球透明市場(chǎng)研究機(jī)構(gòu)（Transparency Market Research）的報(bào)告，到2025年底，全球干細(xì)胞市場(chǎng)規(guī)模預(yù)計(jì)達(dá)到2705億美元，近8年全球干細(xì)胞市場(chǎng)的復(fù)合年增長(zhǎng)率有望達(dá)到13.8%。

為了使細(xì)胞**產(chǎn)品成功應(yīng)用，細(xì)胞的長(zhǎng)期低溫存儲(chǔ)是必須攻克的技術(shù)難點(diǎn)，因?yàn)榈蜏乇４媸情L(zhǎng)期保存細(xì)胞活力和生化功能的**可用方法。

為了避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，一些冷凍保護(hù)劑已經(jīng)上市。*常用的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜（DMSO）與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。

然而，胎牛血清含有異種動(dòng)物源蛋白，可能會(huì)引起未知病原體的人畜共患**。此外，DMSO具有細(xì)胞毒性。據(jù)報(bào)道，DMSO對(duì)組織和細(xì)胞的毒性取決于暴露時(shí)間、溫度和濃度。毒性程度因細(xì)胞類(lèi)型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細(xì)胞的患者中有不良反應(yīng)的報(bào)道。此外，已知DMSO會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）的轉(zhuǎn)錄水平和改變?nèi)蚪M甲基化譜來(lái)影響小鼠胚狀體的表觀(guān)基因組，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠干細(xì)胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開(kāi)發(fā)高效無(wú)毒的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。

 海藻糖是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細(xì)菌、酵母、緩步動(dòng)物和線(xiàn)蟲(chóng)。哺乳動(dòng)物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實(shí)是一種有效的冷凍保護(hù)劑，可以減少冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。其保護(hù)作用既與滲透效應(yīng)有關(guān)，也與細(xì)胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應(yīng)激而損傷和變性。

海藻糖不具有細(xì)胞毒性，已被有效地用于小鼠精細(xì)胞、成人造血干細(xì)胞，間質(zhì)干細(xì)胞，脂肪來(lái)源干細(xì)胞，人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（hESCs） 和人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs） 等不同細(xì)胞類(lèi)型的冷凍儲(chǔ)存。此外，海藻糖還用于臍帶血、骨髓、人類(lèi)移植表肝細(xì)胞和人類(lèi)胰島的冷凍儲(chǔ)存。

阻止海藻糖在細(xì)胞保存中廣泛應(yīng)用的主要障礙是其難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。以前已經(jīng)應(yīng)用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來(lái)幫助海藻糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費(fèi)力耗時(shí)，且可能導(dǎo)致**的細(xì)胞損傷。

該研究探究了在沒(méi)有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨(dú)或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑，低溫保存3種不同類(lèi)型的多能干細(xì)胞系并復(fù)蘇，對(duì)幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了**研究，包括細(xì)胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標(biāo)記物表達(dá)水平、基因組穩(wěn)定性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應(yīng)等，以衡量不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑對(duì)多能干細(xì)胞的低溫保護(hù)能力。

海藻糖（供注射用）（無(wú)菌）

1、產(chǎn)品名：海藻糖（供注射用）（無(wú)菌）

2、中文名稱(chēng)：D(+)-海藻糖二水合物

3、英文名稱(chēng)：D（+）-海藻糖二水合物（注射用）

4、化學(xué)名稱(chēng)：α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡糖苷二水合物

5、型號(hào)：Hipo-S

6、含量測(cè)定：99.3%

7、CAS號(hào)：6138-23-4

8、EINECS登錄號(hào)：202-739-6

9、備案登記號(hào)：F20190000452

10、DMF號(hào)：034401

11、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：符合各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)（Chp，USP，JP，EP）

12、分子式：C12H22O11·2H2O

13、分子量：378.33

14、性狀：白色結(jié)晶性粉末

15、比旋度：+198.8°

16、酸度:6.0

17、氯化物:符合規(guī)定

18、硫酸鹽:符合規(guī)定

19、可溶性淀粉:符合規(guī)定

20、熾灼殘?jiān)?0.04%

21、重金屬:符合規(guī)定

22、水分:9.5%

23、有關(guān)物質(zhì):總雜0.06%，葡萄糖未檢出，麥芽三糖0.06%，**未知單雜未檢出

24、無(wú)菌：符合規(guī)定

25、微生物限度：無(wú)菌

26、細(xì)菌內(nèi)：<0.1IU/g

27、氮：符合規(guī)定

28、含量測(cè)定：99.3%

29、溶解性：易溶于水，溶于熱乙醇，微溶于甲醇，不溶于**、**

30、保存：密封、涼暗干燥處保存，常溫條件下運(yùn)輸。

31、貨號(hào)：008001

32、結(jié)構(gòu)式：